AG Fuchs

Protein basierte zielzellgerichtete Tumortherapien

Forschungsschwerpunkt

Die Arbeitsgruppe beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit der zielzellgerichteten Aufnahme von Proteintoxinen zur Tumor­therapie. Wir versuchen insbesondere die zelluläre Aufnahme des gegen intrazelluläre Zielstrukturen gerichteten Wirkstoffes zu verbessern. Dabei kommen zwei verschiedene Strategien zum Einsatz. In der ersten Strategie werden Proteintoxine rekombinant über einen molekularen Adapter mit dem tumorzellspezifischen Ligand verknüpft (Heisler et al., 2003). Beim Liganden kann es sich um einen Antikörper, ein Fragment davon, einen Wachstumsfaktor oder ein Cytokin handeln. Die verwendeten Toxine sind entweder pflanzliche Ribosomen inaktivierende Proteine, die die 28S-rRNA irreversibel modifizieren, oder ADP-ribosylierende Proteine, die den eukaryoten Elongationsfaktor 2 inaktivieren. Der molekulare Adapter ist so gestaltet, dass er in der Lage ist, die cytosolische Aufnahme des Toxins zu verbessern, zur Akkumulation des Toxins in der Zelle beiträgt und nach dem Zelltod der Zielzelle ein inaktives Toxin zurücklässt (Abb. 1). Bei der zweiten Strategie wird ein spezielles Hefeenzym, das im Menschen kein Pendant besitzt, mit dem Liganden fusioniert (Panjideh et al., BBE, 2008). Nachdem das Fusionsprotein über den Liganden an die Tumorzelle gebunden hat, wird eine inerte Vorstufe eines niedermolekularen Wirkstoffes verabreicht, dass dann am Tumor durch das Enzym in den aktiven Wirkstoff umgewandelt wird (Antikörper dirigierte Enzym-Prodrug-Therapie = ADEPT) (Panjideh et al., IJC, 2008).

Uptake Of Adaptertoxins

Abb.1) <strong>Schematische Darstellung der zellulären Aufnahme von Adaptertoxinen.</strong> PTD, Proteintransduktionsdomäne; CCP, cytosolisch spaltbares Peptid; ECP, endosomal spaltbares Peptid; CEnz, cytosolisch lokalisierte Protease; EEnz, endosomal lokalisierte Protease. Der Ligand hindert die PTD daran, eine unspezifische Aufnahme in Zellen zu ermöglichen (1). Nach Endozytose des Fusionsproteins (2) führt eine enzymatische Spaltung im Endosom zur Freisetzung des Liganden (3) und damit zur Freilegung der PTD, die nunmehr den Transfer ins Zytosol vermitteln kann (4), wo die PTD durch eine weitere enzymatische Spaltung, diesmal innerhalb der CCP, freigesetzt wird (5) und das aktive Enzym zurückbleibt, das die Proteinbiosynthese inhibiert (6). Da das Toxin keine PTD mehr besitzt, verbleibt es innerhalb der Zelle und kann selbst nach Zelltod und Zelllyse keine normal differenzierten Zellen mehr erreichen. Dieser Mechanismus bewirkt also eine Detoxifizierung, ohne den zytotoxischen Effekt innerhalb der Zielzelle zu beeinflussen.

Ziel bei beiden Strategien ist es, die Fusionsproteine hinsichtlich ihrer Produktion, Reinigung und Stabilität sowie Wirksamkeit zu optimieren und dabei die Immunogenität und Nebenwirkungen zu reduzieren. Bislang konnten wir sowohl in vitro (Bachran et al., 2008; Heisler et al., 2005) als auch in vivo (Bachran et al., BJP, 2009; Bachran et al., JI, 2009) im Maustumormodell zeigen, dass durch die kombinierte Anwendung chimärer Adaptertoxine und bestimmten glycosylierten Triterpenoiden (Saponine aus Gypsophila paniculata (Bachran et al., 2006)) die spezifische Toxizität der Adaptertoxine für Tumorzellen drastisch gesteigert wird (Abb. 2). In Abhängigkeit der Zelllinie konnte die Zytotoxizität der Adaptertoxine in der Zellkultur bis zum 385000fachen gesteigert werden (Heisler et al., 2005). Dabei handelt es sich um einen eindeutig synergistischen Effekt, da die beiden Einzelkomponenten in den eingesetzten Konzentrationen keinerlei Wirkung aufweisen. Die subkutane Anwendung an weit voneinander entfernt liegenden Punkten (Nackenfalte und Flanke) führte in einem Tumormodell an BALB/c-Mäusen zu einem 94%igen Rückgang des Tumorvolumens, obwohl nur ein Fünfzigstel derjenigen Menge eingesetzt wurde, die bei alleiniger Anwendung des Adaptertoxins zu einem 71%igen Rückgang führt (Bachran et al., BJP, 2009; Bachran et al., JI, 2009; Fuchs et al., 2007).

Dose Response Combination Therapy

Abb. 2) <strong>Dosis-Wirkungs-Beziehungen bei der kombinierten Anwendung eines chimären Adaptertoxins und eines Saponins.</strong> Jeder Punkt repräsentiert eine Gruppe von fünf Mäusen, die jeweils viermal mit der entsprechenden Kombination behandelt wurden. Anhand der Wirkung und der Nebenwirkungen wurden sechs Kategorien unterschieden, die farblich gekennzeichnet sind. Die Flächen wurden interpoliert. Die Prozentzahlen beschreiben beim therapeutischen Effekt den Rückgang im Tumorvolumen, bei der Letalität die Anzahl der Mäuse.

Im ADEPT-Projekt liegt der derzeitige Schwerpunkt der Arbeiten in der Verbesserung der Proteinstabilität. Dies wird durch die Einführung neuer Glycosylierungsstellen, durch PEGylierung und durch Punktmutationen an proteasesensitiven Motiven erzielt. Die modifizierten Proteine werden an Maustumormodellen für Dickdarmkrebs im Hinblick auf Pharmakokinetik und Pharmakodynamik getestet.

Bei Interesse an unserem Forschungsgebiet wenden Sie sich bitte an: hendrik.fuchs(at)charite.de. In der Arbeitsgruppe können sowohl medizinische, tiermedizinische als auch naturwissenschaftliche Doktorarbeiten angefertigt werden.

Forschungsprojekte

  • • Kontrollierte Wirksamkeitssteigerung von tumorspezifischen Toxinen durch pH-abhängige Freisetzung von Saponinen aus zielgerichteten Nanopartikeln (Deutsche Forschungsgemeinschaft)
  • • Kombinationstherapie von Anti-Tumor-Toxinen und Reinsaponinen am Maustumormodell (Stiftung der Deutschen Wirtschaft)
  • • Saporin/Saponin-Transportsysteme zur zielgerichteten Freisetzung von Wirkstoffen zur Tumortherapie: 1. Entwicklung des Transportsystems und Prüfung im Zellkulturmodell (Wilhelm Sander-Stiftung)
  • • Development of tumor-activated targeted toxins and their investigation in combination with glycosylated triterpenoids (Deutsche Forschungsgemeinschaft)
  • • Saponin vermittelte intrazelluläre Liberation chimärer Toxine. Eine Basistechnologie in der zielzellgerichteten Tumortherapie (Deutsche Forschungsgemeinschaft)
  • Weitere Forschungsprojekte in der Arbeitsgruppe, z. B. zur Signaltransduktion, sind über die Homepage der Gruppe zugänglich.

Ausgewählte Publikationen

Weng A, Thakur M, von Mallinckrodt B, Beceren-Braun F, Gilabert-Oriol R, Wiesner B, Eichhorst J, Böttger S, Melzig MF, Fuchs H.
Saponins modulate the intracellular trafficking of protein toxins.
J Control Release 2012; 28(164):74-86.
Schellmann N, Panjideh H, Fasold P, Bachran D, Bachran C, Deckert PM, Fuchs H.
Targeted tumor therapy with a fusion protein of an antiangiogenic human recombinant scFv and yeast cytosine deaminase.
J Immunother 2012; 35(7):570-8.
Thakur M, Mergel K, Weng A, Frech S, Gilabert-Oriol R, Bachran D, Melzig MF, Fuchs H.
Real time monitoring of the cell viability during treatment with tumor-targeted toxins and saponins using impedance measurement.
Biosens Bioelectron 2012; 35(1):503-6.
Weng A, Thakur M, Beceren-Braun F, Bachran D, Bachran C, Riese SB, Jenett-Siems K, Gilabert-Oriol R, Melzig MF, Fuchs H.
The toxin component of targeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase by saponins.
Mol Oncol. 2012; 6(3):323-32.
Bachran D, Schneider S, Bachran C, Weng A, Melzig MF, Fuchs H.
The endocytic uptake pathways of targeted toxins are influenced by synergistically acting Gypsophila saponins.
Mol Pharm. 2011; 8(6):2262-72.
Bachran D, Schneider S, Bachran C, Urban R, Weng A, Melzig MF, Hoffmann C, Kaufmann AM, Fuchs H.
Epidermal growth factor receptor expression affects the efficacy of the combined application of saponin and a targeted toxin on human cervical carcinoma cells.
Int J Cancer 2010; 127(6):1453-61.
Bachran C, Weng A, Bachran D, Riese SB, Schellmann N, Melzig MF, Fuchs H.
The distribution of saponins in vivo affects their synergy with chimeric toxins against tumours expressing human epidermal growth factor receptors in mice.
Br J Pharmacol 2010; 159(2):345-52.
Bachran, C., Dürkop, H., Sutherland, M., Bachran, D., Müller, C., Weng, A., Melzig, M. F., Fuchs H
Inhibition of tumor growth by targeted toxins in mice is dramatically improved by Saponinum album in a synergistic way..
J Immunother 2009; 32(7):713–725.
Bachran C, Schneider S, Riese SB, Bachran D, Urban R, Schellmann N, Zahn C, Sutherland M, Fuchs H.
A lysine-free mutant of epidermal growth factor as targeting moiety of a targeted toxin.
Life Sci 2011; 88(5-6):226-32.
Thakur M, Mergel K, Weng A, von Mallinckrodt B, Gilabert-Oriol R, Dürkop H, Melzig MF, Fuchs H.
Targeted tumor therapy by epidermal growth factor appended toxin and purified saponin: An evaluation of toxicity and therapeutic potential in syngeneic tumor bearing mice.
Mol Oncol 2012;

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